WIWAM植物表型成像系統由比利時(shí)SMO公司與Ghent大學(xué)VIB研究所研制生產(chǎn)，整合了LED植物智能培養、自動(dòng) 化控制系統、葉綠素熒光成像測量分析、植物熱成像分析、植物近紅外成像分析、植物高光譜分析、植物多光譜分 析、植物CT斷層掃描分析、自動(dòng)條碼識別管理、RGB真彩3D成像等多項*技術(shù)，以較優(yōu)化的方式實(shí)現大量植物樣 品——從擬南芥、玉米到各種其它植物的生理生態(tài)與形態(tài)結構成像分析，用于高通量植物表型成像分析測量、植 物脅迫響應成像分析測量、植物生長(cháng)分析測量、生態(tài)毒理學(xué)研究、性狀識別及植物生理生態(tài)分析研究等。

室內植物表型成像系統WIWAM Line

不同生長(cháng)條件下擬南芥GRF3類(lèi)轉錄因子促進(jìn)葉片的顯著(zhù)增長(cháng)

作物產(chǎn)量的增加對于確保糧食安全以滿(mǎn)足不斷增長(cháng)的全球需求至關(guān)重要。一些基因修飾可以增加器官的大小，從而提高作物產(chǎn)量。盡管如此，只有在少數情況下，在脅迫條件下對其性能進(jìn)行了評估。MicroRNA miR396抑制生長(cháng)調節因子（GRF）基因的表達，GRF基因編碼促進(jìn)器官生長(cháng)的轉錄因子。本文表面擬南芥At-GRF2和At-GRF3抗miR396活性基因（rGRF2和rGRF3）都增加了器官大小，但只有rGRF3可以產(chǎn)生這種效應而不會(huì )造成形態(tài)學(xué)缺陷。此外在甘藍中引入At-rGRF3可以增加器官的大小，而在擬南芥中引入大豆和水稻的At-rGRF3同源物也會(huì )增加葉片的大小。這表明miR396對GRF3活性的調節對于許多物種的器官生長(cháng)是重要的。在干旱脅迫下，含有rGRF3的植物也有較大的葉片，這一條件刺激了miR396的積累。這些植物還表現出對毒力細菌的抗性增強，這表明rGRF3促進(jìn)的大小增加在植物防御上沒(méi)有明顯的成本。我們的研究結果表明，rGRF3可以在正常和脅迫條件下增加植物器官的大小，是一種有價(jià)值的生物技術(shù)應用工具。

圖1.miRNA miR 396對GFR轉錄因子的廣泛控制

在擬南芥中有九個(gè)GRF（圖1a，b），其中七個(gè)GRF的miR396靶位位于編碼WRC結構域羧基端的區域（圖1b，c）。miRNA靶點(diǎn)在不同的GRF中是相同的，但位置8處除外，其中GRF 1-4中有一個(gè)C，GRF 7-8中有一個(gè)a，GRF9中有一個(gè)U（圖1c）。該可變堿基相對于miRNA位于凸起位置，因此對于所有轉錄因子而言，與miRNA的相互作用非常相似，然而，WRC結構域羧基端的編碼氨基酸序列不同（圖1c）。有趣的是，擬南芥GRF基因結構顯示外顯子-內含子組織和定義該家族的蛋白質(zhì)結構域分布的差異（圖1b）。我們分析了不同被子植物GRF中miRNA靶點(diǎn)的出現情況（圖1d）。在許多物種中，如毛果楊、大豆和截形苜蓿，所有GRF都有一個(gè)miR396結合位點(diǎn)（圖1d），而在其他物種中，如擬南芥和水稻，一些基因缺少該序列。有趣的是，在擬南芥GRF5中有一個(gè)與miRNA靶點(diǎn)非常相似的序列，這是該物種中缺少miR396調控的兩個(gè)GRF之一（圖1c）。這些發(fā)現表明miR396廣泛分布GRF調節，并提示這可能是這些轉錄因子在被子植物中的默認狀態(tài)。

圖2.與rGRF2相比，rGRF3 在增加葉片尺寸方面的能力更強

分析了大約30株含有rGRF2 或 rGRF3的初級轉基因植物（圖2a，b），它們從它們自己的啟動(dòng)子中表達出來(lái)。盡管兩種構建體都能夠增加葉面積，但由 rGRF3引起的效果顯著(zhù)高于使用 rGRF2 獲得的效果。然后我們選擇了rGRF2和rGRF3 純合T3轉基因系并確定了GRF 轉錄水平（圖2d）。我們發(fā)現GRF3表達增加2倍足以改變70%的葉面積，而GRF2 轉錄本增加25倍以上需要引起器官大小的類(lèi)似增加（圖 2d，e）. 在這兩種情況下，器官大小的增加是由于細胞數量的類(lèi)似增加，細胞大小沒(méi)有明顯變化（圖2e、f 和 g）。

對rGRF2植物的進(jìn)一步分析表明，葉片具有形態(tài)缺陷，包括長(cháng)而扭曲的葉柄，葉片向下卷曲（圖2c）。另一方面，rGRF3植株除了葉面積增加外沒(méi)有觀(guān)察到明顯的形態(tài)變化。我們認為增加葉片尺寸所需的高水平GRF2也會(huì )導致植物發(fā)育中的額外形態(tài)缺陷。 為了確認啟動(dòng)子不是rGRF2和rGRF3之間觀(guān)察到的差異的原因，我們從GRF3啟動(dòng)子中表達了rGRF2 和 rGRF3，并觀(guān)察到pGRF3:rGRF3比pGRF3:rGRF2引起更大的葉面積增加（圖 2h）. 因此，表達水平和GRF蛋白序列都應被視為有效增強植物器官大小。如圖所示，雖然兩種rGRF均可用于增加器官大小，但rGRF3是植物器官大小的更活躍和特異性增強劑。

圖3.rGRF3樣基因增加異源物種的器官大小

本文分析了來(lái)自rice6和soybean8的GRF轉錄因子序列數據庫，并選擇了與At-GRF3最相似的數據庫。然后，我們在擬南芥At-GRF3啟動(dòng)子下表達了大豆和水稻擬南芥GRF3樣編碼序列。由于這兩個(gè)基因都有一個(gè)miR396靶點(diǎn)，我們引入了同義突變以避免被小RNA識別。我們觀(guān)察到由大豆和水稻rGRF3樣轉錄因子引起的葉片大小增加（圖3a，b）。為了評估rGRF3對其他物種葉片大小的影響，我們在甘藍型油菜轉基因植物中表達了轉錄因子（圖3e）。對兩個(gè)獨立轉基因系的分析顯示，葉面積顯著(zhù)增加20%和32%（圖3c，d）。對轉基因葉片的進(jìn)一步表征表明，葉片大小的增加是由更多的細胞引起的，而不是由細胞大小的影響引起的（圖3c）。對甘藍rGRF3#10植物根系生長(cháng)的評估表明，這些植物的初生根比對照植物的伸長(cháng)率更高（圖3h，i）。此外，這些植物的種子大小也增加了10%（圖3f，g）。綜上所述，這些結果表明，當與miR396調控脫鉤時(shí)，來(lái)自不同物種的AtGRF3樣序列有力地增加了幾個(gè)器官的大小，包括葉、根和種子。

圖4.miR396-GRF系統對干旱脅迫的響應

干旱脅迫是一種相當復雜的情況，根據脅迫的大小和植物的發(fā)育階段會(huì )觸發(fā)不同的反應途徑。特別是，水限制條件抑制發(fā)育中器官的細胞增殖和擴張和/或在成熟器官中誘導一系列復雜的耐受和存活反應。在田間條件下，有限的水供應通常會(huì )降低植物生長(cháng)、生物量積累，從而降低種子產(chǎn)量。使用自動(dòng)表型分析平臺 WIWAM評估了植物對適度干旱脅迫的反應，包括土壤含水量減少。在這些條件下，用空載體轉化的對照植物的蓮座面積減少了40%（圖 4a），葉1面積減少了35%（圖4f）。

使用轉錄報告基因 MIR396B:GUS 觀(guān)察了 MIR396B 的表達，這使我們能夠監測葉子中的 miR396 編碼基因的表達。播種后第 11 天 (DAS) 在澆水良好的盆中 MIR396B 在葉片 3 的近端以低水平表達，即仍處于增殖狀態(tài)（圖4b）。 MIR396B:GUS 的最高表達出現在葉的遠端區域，在該區域中細胞退出細胞周期。當植物受到輕度干旱脅迫時(shí)，葉片尺寸減小，并且在更大的遠端葉區域中檢測到 MIR396B:GUS 表達，并且染色更強烈（圖4b、c）。因此，小RNA 印跡顯示，受脅迫植物的發(fā)育葉片中成熟 miR396 水平增加了 70%（圖4d）。相比之下，At-GRF3 轉錄水平降低了約 60%（圖4e）?？傊?，這些結果表明 miR396 網(wǎng)絡(luò )響應干旱脅迫。然后我們評估了miR396-GRF3 調控nde在干旱脅迫期間的作用。為此我們首先分析了35S:miR396 植物對輕度干旱脅迫的反應，由于miRNA 的過(guò)度表達和 GRFs12 的抑制，這些植物的葉子很?。▓D4f）。當對這些植物施加干旱脅迫時(shí)，未觀(guān)察到器官大小的進(jìn)一步減?。▓D4f），表明轉基因 miR396 過(guò)表達掩蓋了源自?xún)仍葱哉T導的MIR396B的影響。

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