Transcriptome analysis of Pinus halepensis under drought stress and during recovery

干旱脅迫下黑松恢復期的轉錄組分析

林木利用各種策略來(lái)應對干旱脅迫，這些策略涉及復雜的分子機制。黑松分布于整個(gè)地中海盆地，是最耐旱的松種之一。為了破譯黑松用來(lái)抵御干旱的分子機制，我們進(jìn)行了大規模的生理和轉錄組分析。本文從一個(gè)生長(cháng)條件不理想的半干旱地區選擇了一棵成熟的樹(shù)木進(jìn)行扦插繁殖。然后使用高通量實(shí)驗系統連續監測整個(gè)植物的蒸騰速率、氣孔導度和VPD。在氣孔前反應、部分氣孔關(guān)閉、最小蒸騰、灌水后、部分恢復和*恢復六個(gè)生理階段對植物的轉錄組進(jìn)行了檢測。在每個(gè)階段，將暴露于干旱處理的植物的數據與從灌溉良好的對照植物收集的數據進(jìn)行比較。干旱脅迫下的黑松轉錄組是使用雙端 RNA-seq 創(chuàng )建的。在經(jīng)過(guò)干旱處理的樹(shù)木和對照樹(shù)木之間，總共鑒定出約6000個(gè)差異表達的非冗余轉錄本。聚類(lèi)分析揭示了與光合作用、活性氧 (ROS) 通過(guò)抗壞血酸 (AsA) 循環(huán)清除、脂肪酸和細胞壁生物合成、氣孔活性以及類(lèi)黃酮和萜類(lèi)化合物的生物合成相關(guān)的轉錄物的應激誘導下調。上調的過(guò)程包括葉綠素降解、通過(guò)AsA非依賴(lài)性硫醇介導的途徑清除活性氧、脫落酸反應和熱休克蛋白、thaumatin和exordium的積累。干旱恢復誘導逆轉錄轉座子的強烈轉錄，尤其是逆轉錄病毒相關(guān)轉座子1-94。干旱相關(guān)轉錄組闡明了該物種對干旱和恢復的動(dòng)態(tài)反應，并揭示了新的機制。

圖1.干旱和恢復過(guò)程中黑松全株蒸騰速率和冠層氣孔導度的變化

本文評估了在不同灌溉制度下生長(cháng)的植物的生理反應。最初，對植物進(jìn)行7天的充分灌溉，然后暫停灌溉46天，以施加越來(lái)越大的脅迫壓力，然后恢復灌溉。監測兩個(gè)主要參數以確定干旱嚴重程度：中午的E和中午的gsc。與停止灌溉19天后的對照植物相比，干旱處理導致第26天中午E和gsc顯著(zhù)減少（圖1）。盡管圖1B中的E是五個(gè)重復的平均值，圖1C中的gsc是單個(gè)植物的，但在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中E的模式與gsc的模式匹配，并且這兩個(gè)參數與VPD的每日變化相關(guān)（圖1）。隨著(zhù)干旱的持續，干旱處理的樹(shù)木的gsc從第21天的319逐漸下降到第26天的171，并在干旱期結束時(shí)降至94 mmol s-1 g-1（圖1C）?；謴凸喔群?，經(jīng)干旱處理的樹(shù)木的E和gsc恢復到干旱處理前記錄的水平，表明干旱處理并非結束。在gsc的基礎上，選擇了兩株干旱處理和兩株灌溉（對照）樹(shù)木，在六個(gè)不同生理階段進(jìn)行分子研究。選擇的轉錄組分析階段（圖1C）如下：（D1）第 21 天的氣孔前反應，319 gsc；(D2) 第27天氣孔部分關(guān)閉，171gsc；(D3) 第 53 天的最小蒸騰作用，94 gsc；(D4) 在第54天用116gsc 灌溉后；(D5) 在第56天部分恢復，271gsc； (D6) 在第69天*恢復，gsc為523mmol s-1g-1。

圖2.響應干旱和恢復的差異表達（DE）轉錄本

在上述六個(gè)生理階段對干旱處理和對照樹(shù)木的基因表達譜分析使我們能夠分析在干旱處理植物和對照植物之間差異表達的轉錄本（圖2）。一般來(lái)說(shuō)，隨著(zhù)干旱的進(jìn)展，DE轉錄物的數量逐漸增加，在恢復過(guò)程中逐漸減少。轉錄下調在干旱響應中占主導地位，而在重新澆水和整個(gè)恢復期間，轉錄上調占主導地位（圖2）。在 D1 階段的干旱處理和對照克隆中僅鑒定出 27 個(gè)上調和 27 個(gè)下調的轉錄本。與在 D2 階段收集的生理數據一致，此時(shí)注意到 gsc 減少（圖2B），223個(gè)轉錄本上調，而370個(gè)轉錄本下調。在D3階段，在觀(guān)察到的蒸騰速率和gsc時(shí)（圖1B和3B），注意到878個(gè)轉錄本的上調和1490個(gè)轉錄本的下調。再澆水幾個(gè)小時(shí)后，在D4階段，2071個(gè)轉錄本上調，而1505個(gè)轉錄本下調。這些數字在D5階段（部分恢復）減少到537個(gè)上調轉錄本和510個(gè)下調轉錄本。上調轉錄本的數量在 D6 階段（*恢復）急劇增加至1275，而此時(shí)下調轉錄本的數量已下降至336（圖 2A）?？偣舶l(fā)現黑松轉錄組包含 6035個(gè)DE轉錄本，其中2466個(gè)先前報道過(guò)，3567個(gè)是從頭組裝的。轉錄組包括1035 (17%) 個(gè)無(wú)注釋的重疊群和 650 (10.1%) 個(gè)與逆轉錄轉座元件相關(guān)的重疊群。為了識別不同生理階段常見(jiàn)的轉錄本，分別為D2-D6階段的上調和下調轉錄本生成了兩個(gè)維恩圖（圖2C和D）。下調轉錄本的最高重疊在階段D3和D4之間，這表明 >50% 的常見(jiàn)轉錄本表明重新澆水后逐漸恢復。上調轉錄物的最高重疊D4和D6之間，其中大多數是逆轉錄轉座子。上調轉錄本的第二高重疊在D3和D4之間，表明重新澆水后逐漸恢復。

圖3.干旱和恢復期間黑松中反轉錄轉座子的表達模式

集群20主要由在D4和D6階段上調的轉錄本主導。該集群包括1405個(gè)轉錄本，其中646個(gè)轉錄本沒(méi)有注釋。該集群還包括與逆轉錄轉座子相關(guān)的489個(gè)轉錄本。這些誘導的逆轉錄轉座子屬于HAT、Ty1、Ty3 和Tf2家族（圖6）。然而，具有243個(gè)相關(guān)轉錄本的最主要的逆轉錄轉座子是1-94（圖6B 和C）。在該簇的其余275個(gè)轉錄本中，8個(gè)是TF，44個(gè)與光合作用相關(guān)，22個(gè)過(guò)氧化物酶-64轉錄本，18個(gè)核糖核酸酶 (RNase) H轉錄本和10個(gè)內切核糖核酸酶切丁酶轉錄本。在簇6和27中看到了28個(gè)逆轉錄轉座元件的類(lèi)似模式，它們總共包括130個(gè)轉錄本。